荧光计:将波(长度)读取到大数据

荧光标签的使用可能是无限的,范围从报告基因到荧光标记的亲和试剂测定。功能强大的高端多模板读取器,  能够进行大量高通量筛选分析,并具有环境控制,机器人,液体处理,扫描波长发射**小/**大值的能力,以及通常激光激发,时间分辨荧光或荧光偏振 - 可能是制药,生物技术和核心实验室的宠儿。但对于普通的分子生物学或蛋白质组学实验室来说,这些仪器可能有点过分。随着诸如新一代测序等应用的普及,对工作流程中的质量控制(QC)和准确定量的需求不断增长。

许多现成的荧光解决方案都可用于此目的。在此,将特定于给定物种的分子(例如,双链DNA)的荧光探针添加到样品中。当被引入荧光计时,其使用一个波长的光激发样品并捕获第二个更长波长的近乎瞬时的发射,发现它们的靶的探针将发荧光,荧光量与靶的数量成比例。对原始样本感兴趣。

在这里,我们看一下荧光计,这些荧光计设计用于运行越来越多的测定,用于确保DNA,RNA和蛋白质制剂符合下游应用的标准。

一个或多个

荧光计  有许多替代名称:荧光分光光度计,荧光光谱仪,荧光计或荧光分光光度计。这些仪器的核心是激发样品并读取其斯托克斯位移发射。荧光计不同于紫外/可见(UV / VIS)分光光度计,它们通过样品照射光并测量吸收(或透射)多少入射光。荧光计也不同于发光计,后者测量未发光样品发出的光。将这些功能组合到一个盒子中变得越来越普遍,通常称为“多模式阅读器”。

可以以各种方式分析样品。通常,高通量读取器通常依赖于微孔板,而那些设计用于一次运行少于20个样品的读取器通常使用玻璃,石英或塑料比色皿或管,甚**测量单滴。使用为此目的而创建的容器非常重要 - 不仅要确保合身,还要考虑材料的光学特性(例如,大多数玻璃对UV光不透明)。

荧光计可配备可调单色器,限制允许照射样品的光波长,到达检测器的波长或两者。这些仪器的优点是可以查询几乎任何激发/发射曲线的荧光团。类似地,因为基于单色仪的仪器通常能够扫描其范围内的所有波长,所以它们可用于确定用于测定开发的峰值激发和吸光度。另一方面,荧光计可以装配有过滤器组,这些过滤器组通常比单色器更便宜并且通常更灵敏,但是具有将用户锁定到特定的发射/激发曲线(或必须更换过滤器组)的缺点。

**重要的是方便

许多基因组学,蛋白质组学和一般生命科学实验室都有兴趣购买已经开发和验证的现成分析,而不是设计自己的分析。他们想知道,“那里有多少DNA?那里有多少RNA?多少蛋白质?“ DeNovix市场开发经理Andrew Jones说。

Eppendorf North America的产品经理杰西卡·盖斯勒指出,荧光是比通过无标记紫外线吸收来量化样品“更昂贵,更有效”的方式。然而,由于其精确的灵敏度 - 有时在低皮克/毫升和特异性,“它已成为使用荧光测量的黄金标准。”

当然,这种特异性是一把双刃剑:单链DNA(ssDNA)的荧光检测可以准确测量ssDNA存在的程度,但它无法判断是否存在任何溶剂或样品中的RNA。(因此,对于像下一代测序这样的挑剔应用,通常需要结合使用方法。)

一类属于自己的

许多荧光计适应生命科学中对运行简单质量控制(QC)和定量分析的需求。单个仪器很少能提供所有解决方案,但此类仪器确实具有一些共同特征。它们是针对单个样品而设计的,因此与其微孔板读数相比往往较小。它们是基于过滤器的,并且往往相对便宜,从大约1,000美元到略多于10,000美元不等。它们是独立的,因为它们的操作是在船上并且不需要外部计算机。它们强调易用性,具有(可选)预编程协议和虚拟按钮操作。

其中一些仪器大致类似于传统的分光光度计,具有一个或两个附加功能。 例如,Jenway的62系列荧光计具有标准的10毫米比色皿支架,使用氙灯和光电倍增管检测器,可以产生原始荧光或浓度,MIDSCI分销商产品经理Elise Ambrose解释道。**多可编程20种方法,将结果存储在板上并将数据传输到计算机。此外,这些仪器还具有动态读数的定时测量功能,并提供可编程吸管泵和加热器等附件。

Eppendorf的BioSpectrometer®是一种标准的UV / VIS扫描分光光度计,带有集成的固定波长荧光计,使用标准比色皿或微量体积比色皿(使用一滴样品)。“其中的荧光应用协议是测量分子生物学分子:DNA,RNA,ssDNA和蛋白质。这些都是非常常见的套件,“盖斯勒说。其中绝大多数使用绿色或橙色荧光,因此BioSpectrometer只有一个LED和两个滤光片:绿色和橙色。

DeNovix新推出的QFX型号拥有四个荧光计通道 - 四个LED光源,配有紫外,红色,绿色和蓝色滤光片。琼斯说:“这是关于它的灵活性,不仅仅是运行当前用户希望运行的分析方法,而且还有多容易合并新的分析方法。” 他指出了一种新的检测方法,在高紫外线范围内激发,“这使我们可以降**1 pg /μl,这是非常棒的性能。随着新荧光团的开发,我们能够直接利用它。“DeNovix的仪器 - 包括DS-11 FX  系列中的仪器,也具有UV / VIS功能 - 装载了一系列标准分析以及能够创建自定义分析。这些可以作为仪器的7英寸Android触摸屏上的应用程序访问。

一种非常受欢迎的设备是 来自Thermo Fisher Scientific 的双色Qubit™3.0荧光计 - 一种大约5 x 10 x 2英寸的设备,顶部带有触摸屏和管样品架。**产品经理Kathy Free表示,“Qubit专门设计用于简化DNA,RNA和蛋白质的荧光定量”,并将自动计算样品浓度。Qubit分析设计使用两点标准曲线(与其他平台的分析相比,例如Thermo Fisher的Quant-iT,它使用8点标准曲线)。该仪器还可用于“荧光计模式”,以直接检测常见的荧光团,如GFP或第三方检测。

具有类似外形的设备也出现在市场上并从市场上消失。例如,Promega去年停止使用QuantiFluor®仪器,用双色3英寸LCD屏蔽Quantus™荧光计代替它们。

同样,试剂制造商Biotium以AccuLite™  品牌销售两台单色AC / DC仪器。“他们像Qubit一样工作。主要优势是价格 - 它们非常便宜,“Biotium**科学家Lori Roberts说。Sigma-Aldrich也以FluoroSELECT™品牌销售多个单通道荧光计。

随着发光

荧光检测为QC和蛋白质,核酸和其他生物分子的定量提供了**的选择性和灵敏度,并且有很多简单的选择让您阅读它们。只需选择 - 无论是大型,快速和花哨的东西,还有许多花里胡哨的东西,电池供电的设备可以从单个管中读取单一颜色或介于两者之间。