蛋白质的紫外线吸收如何影响分析?

诸如动​​物组织和植物中的蛋白质之类的蛋白质会强烈吸收大约280 nm的紫外线(UV)。而是由一些氨基酸组成吸收紫外线的蛋白质。蛋白质对紫外线的强烈吸收可以通过显微镜和显微光谱法快速检测和鉴定液体和固体蛋白质样品。

氨基酸

通常,蛋白质的光吸收是在280 nm处测量的。在此波长下,蛋白质的吸收主要是由于色氨酸,酪氨酸和半胱氨酸氨基酸,其摩尔吸收系数按此顺序降低。当然,蛋白质本身在280 nm处的摩尔吸收系数将取决于这三个氨基酸各自的相对浓度。因此,不同的蛋白质可能具有不同的吸收系数,甚至**大吸收的波长也可能不同。通过相对较快和简单的光学测试,该事实可用于帮助鉴定不同类型的蛋白质。  

通过紫外线吸收对蛋白质成像

**常见的是,蛋白质晶体通过其固有的蛋白质荧光来成像。这主要是色氨酸的荧光。因此,蛋白质荧光需要非常强大的紫外线光源和非常灵敏的照相机,因为蛋白质发出的荧光非常微弱。但是,强大的紫外线光源会因获取大量数据所需的长时间曝光而破坏蛋白质。

在细胞,组织或晶体中对蛋白质成像的更快方法是利用其对紫外线的强烈吸收作为对比机制。通过使用配备有用于UV成像的紫外显微镜或显微分光光度计,可以用280 nm的光对包含蛋白质的样品进行成像。该蛋白质将比周围的样品更强地吸收该光,并且看起来更暗。有关盐溶液中蛋白质晶体的紫外线吸收的示例,请参见上图。这项技术非常快,将蛋白质暴露在紫外线下的时间要短得多。

紫外吸收光谱分析蛋白质

显微分光光度计用于通过紫外线吸收来获取包含蛋白质(例如单个蛋白质晶体)的显微样品的光谱。显微分光光度计由集成了分光光度计的紫外可见近红外范围显微镜组成。因此,它能够测量组织,蛋白质晶体和其他含蛋白质结构的显微样品的紫外-可见-近红外光谱。通过吸收,它能够快速,无损地测量这些样品。

显微光谱使用户可以了解有关蛋白质的光学特征和化学结构的更多信息。另外,由于在280 nm处的吸收与蛋白质浓度成正比,因此显微光谱还可以确定样品中蛋白质的浓度。

如果蛋白质样品不含色氨酸或酪氨酸,两者均在280 nm处吸收,则浓度仍可通过Scopes方法轻松测量。在这种特定方法中,蛋白质浓度由在205 nm处的吸收确定,在该处直接分析肽键。 

DNA或RNA纯度也可以通过测量260至280 nm的吸收比来确定。这是因为组成DNA和RNA的核酸在260 nm处吸收很强。对于RNA,大约2.0的比率被认为是“纯”的,而对于DNA,大约1.8的比率被认为是“纯”的。较低的比率表明存在蛋白质。  

摘要

蛋白质由于其组成氨基酸的三种类型而在280 nm处强烈吸收。在氨基酸中发现的肽键也在205 nm处吸收。蛋白质的紫外线吸收可用于快速成像和无损获取显微样品的光谱。光谱还可以用于确定蛋白质浓度和蛋白质相对于DNA或RNA的相对量。