提高1微升紫外 - 可见定量准确度的五种方法

通过紫外 - 可见(UV-vis)分光光度法测量微升体积样品的能力 在过去十年中引发了分子生物学实验室的革命。了解使用微量体积分光光度计准备和测量样品的**佳实践将帮助您避免错误来源,这会对结果的准确性产生负面影响并影响样品的下游分析。

DeNovix Inc.  由微量分光光度法**域的原始创新者建立。DeNovix科学家在吸光度和荧光分析方面拥有数十年的综合经验,并提供了**佳实践指南,以避免常见错误并确保**和准确的结果。


1.样品制备的重要性

确保优化样品分离方案,并在测量前纯化样品。请记住,UV-vis规范不区分感兴趣的样品和在相同波长下吸收的污染物。所有核酸在260nm处或附近显示出峰。双链DNA样品溶液中的降解或单链DNA导致260nm处的总吸光度,导致高估报道的浓度。

监测测量的吸光度比率可以深入了解样品的纯度,并有助于识别样品制备中的潜在问题。纯DNA和RNA制剂的A260 / A280比率分别为1.8和2.0,A260 / 230比率为2**2.2。偏离这些可以表明蛋白质对于前者的比率或碳水化合物,胍,苯酚或糖原的后续比率的携带。当不适当的溶液用作空白时,或者样品非常稀释并接近检测下限时,纯度比也可能受到影响。

2.样品表面清洁

在装入毛坯或样品之前确保顶部和底部测量表面都是干净的,这对于避免后续读数出现问题非常重要。在脏的采样表面(顶部或底部)上执行空白测量将导致错误的吸光度值,例如负光谱(图1),或计算的样品浓度低于实际值。一些样品的缓冲液中的洗涤剂或醇可能在一段时间内导致测量表面的无条件,导致样品平放而不是在基座上形成珠子。如果观察到任何所述问题,在重新消隐并继续测量样品之前,务必遵循制造商推荐的清洁方案。

图。1

3.空白测量和缓冲

适当的空白是**浓度测量的先决条件。使用悬浮样品的相同缓冲液进行空白读数,并确保在加载前测量表面是干净的。在运行样品时看到负光谱是一个强有力的指标,表明样品基座脏了或样品被测量为错误的空白。选择缓冲液时,请避免使用含有在目标波长下吸收强烈的成分的缓冲液。一个例子是悬浮在RIPA缓冲液中的蛋白质,其在280nm处具有高吸光度。当需要此类缓冲液时,建议使用比色分析。缓冲液的吸光度曲线可以通过用水冲洗并将缓冲液作为样品运行来检查。

4.在分光光度计的检测限内测量样品

所有分光光度计都具有由环境和电子元件贡献的可检测水平的背景噪声。仪器的检测下限可以定义为可以与背景噪声区分的**低分析物数量。公差规格可以是百分比值或特定分析物的浓度。例如,如果dsDNA的耐受性规格为2 ng /μl,则由于电噪声的影响,浓度为4 ng /μl的样品可能在2到6 ng /μl的范围内。(见表1)

当处理检测下限或接近检测限的样品时,从DS-11 +紫外 - 可见分光光度计切换到微量体积到较长路径长度的1-cm比色杯模式,可将可接受的较低测量范围扩展20倍。

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5.常规**​​佳实践

•在测量之前,通过涡旋确保样品溶液是均匀的。
•移液样品时避免引入气泡。
•使用经过校准的移液器和正确安装的吸头,确保将完整的1μl等分试样输送到测量表面。
•目视确认等分试样已送**测量表面。蛋白质样品可能芯吸到**的外部,可能无法正确分配。
•为每个样品使用新的提示,并始终使用新鲜的等分试样进行任何重复。
•每次测量后立即使用干燥的实验室擦拭布从顶部和底部表面上取下样品。

概要

能够以微升体积**测量样品的紫外 - 可见吸光度,使研究人员能够在执行对下游应用**关重要的质量控制步骤时保存其珍贵材料。在量化核酸或蛋白质时采用这些简单的技巧将为您的微量测量提供额外的准确性和信心。