使用TC-700P的超耐热纤维素酶的热变性分析

介绍

蛋白质的热力学性质和二级结构揭示了关于它们的结构和因此它们的功能的重要信息。虽然差示扫描量热法(DSC)和CD光谱学通常用于测量蛋白质的热变性,但是CD光谱法具有比DSC更多的优点。例如,可以使用较低的蛋白质浓度在各种pH和较宽范围的溶剂条件下测量CD光谱。然而,由于水基溶液的沸点限制,CD光谱通常不能在高于100℃的温度下测量。

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温度控制器

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TC-700样品架

 

因此,JASCO开发了用于高于100°C高温测量的TC-700 / 700PC高压/高温测量样品室。TC-700允许在高达170℃的温度下通过使用市售N2气体将样品溶液加压**1MPa来测量CD光谱。现在可以使用TC-700测量探测超级热稳定蛋白的热变性的CD测量。

本应用简报介绍了使用TC-700PC和变性分析程序的超级热稳定纤维素的热变性分析。

**词

热变性,热稳定性,圆二色性,J-1500,TC-700 / 700PC,变性分析,超耐热纤维素酶

实验

测量条件
数据采集​​间隔 0.1nm
光谱带宽 1nm
响应时间 2秒
温度间隔* 0.1℃
路径长度 10mm
扫描速度 100nm / min
压力 0.8MPa
温度斜率* 1℃/ min

*对于在220nm监测的CD热变性曲线。

将1.2mg / mL的在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中的超热稳定纤维素用蒸馏水稀释**所需浓度,并使用J-1500和TC-700PC进行测量。

结果

在45,80,100和120℃下测量0.01mg / mL超耐热纤维素酶的CD光谱,如图1所示。超级热稳定纤维素酶在高达90℃的温度下保持其活性,这与我们的数据一致说明仅在100℃以上的温度下才能看到蛋白质的热变性。

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图1.在45℃(红色),80℃(蓝色),100℃(黄色)和120℃(绿色)的0.01mg / mL超耐热纤维素的远紫外(195-260nm) )。

还在220nm下获得CD测量值,以探测超耐热纤维素酶的热变性。使用变性分析程序的结果和分析示于图2中。与图1一致,在超过100℃的温度下,CD值急剧下降,表明二级结构的损失和蛋白质的变性超过100° C。通过变性分析软件计算超耐热纤维素酶的解链温度(Tm),发现为106.3℃。

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图1. 0.025 mg / mL超热稳定纤维素酶的热变性结果

结论

本应用简报说明,通过使用带有J-1500 CD光谱仪的TC-700 / 700PC,可以在高于100°C的温度下测量热变性曲线,以测试具有高熔融温度的热稳定蛋白。